摘 要：研究 12 種植物精油的主要成分及其對 3 種常見雞源致病菌( 雞大腸桿菌、雞白痢沙門菌及雞金黃色葡萄球菌) 的抑制作用，采用微量二倍稀釋法測定各精油對 3 種致病菌的最小抑菌濃度( MIC) ，在質量濃度0. 391 ～ 25. 000 mg /mL 內，各精油對各致病菌均表現出抑制活性，且百里香酚和香芹酚復配后的協同作用明顯，為進一步對植物精油的開發利用提供科學依據。
關鍵詞：植物精油; 最小抑菌濃度; 致病菌; 復配; 協同作用
作者：魏磊，李曉，王偉，王學方，郭唯，董建軍

幼仔飼養已成為現代畜禽養殖業中最重要最關鍵的環節之一。幼仔的發病率及病死率很高，是由于其消化系統發育不健全，免疫力低下，加之各種應激反應所致。抗生素和化學合成抗菌藥物的廣泛應用明顯改善了這種局面，但近年來引起畜禽產品的藥物殘留和耐藥菌株產生的問題越來越為社會所關注，因此在當前飼料添加劑行業中，尋找和研究優質、安全、高效及穩定的抗生素替代品迫在眉睫［1 － 2］。近年來新型抗菌殺菌添加劑的研究越來越多，尤其是以天然植物提取物( 毒副作用低、無有害藥殘及不易產生抗藥性等特點) 作為飼料添加劑備受重視。

研究表明，植物精油生物活性廣泛，具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、解熱鎮痛、祛痰止咳和改善胃腸功能等功效［3］。我國植物精油資源豐富，是一種很有開發潛力及應用前景的飼料添加劑，因此進行深入研究，開發獸用植物新產品具有較大的應用價值，且前景廣闊。

研究對市售的 12 種植物精油，包括羅勒油、大蒜油、山蒼籽油、藍桉油、安息香油、檸檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚進行主要成分檢測和體外抑菌作用測試，并對它們間的相互作用進行研究，為畜禽用天然植物源殺菌劑的開發與應用提供理論依據。

1 材料與方法
1.1 試驗材料與儀器
1.1.1 試驗材料
12 種市售植物精油: 羅勒油、大蒜油、山蒼籽油、藍桉油、安息香油、檸檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚; 3 種常見臨床致病菌:雞大腸桿菌 CVCC 1555、雞白痢沙門菌 CVCC 1887和雞金黃色葡萄球菌 CVCC 548，購自中國獸醫藥品監察所; 肉湯培養基和營養瓊脂等均為國產; GC －MS 用甲醇為色譜純試劑。
1.1.2 試驗儀器
ME－204 電 子 天 平，無錫一凈超凈工作臺，SYQ－DSX－280B 手提式壓力蒸汽滅菌鍋，Galaxy170S 生化培養箱等，GC－MS－QP2010Ultra氣相色譜－質譜聯用儀。
1.2 試驗方法
1.2.1 12種植物精油 GC－MS 分析
色譜 柱 為 Ｒtx － 5Sil MS 彈性石英毛細管柱( 30. 00 m × 0. 25 mm，0. 25 μm) ; 升溫程序，起始為 60 ℃，以 10 ℃ /min 升至 150 ℃，再以 6 ℃ /min升至 250 ℃，保留 10 min，進樣口溫度為 250 ℃ ;進樣量 1. 0 μL，不分流; 載氣為高純度氦氣，柱內載氣流量為 1. 0 mL /min; 質譜用 EI 電離源，接口溫度為280 ℃，電子能量 70 eV，離子源溫度 230 ℃;掃描質量 35 ～ 600 aum; 倍增器電壓 2 kV; 質譜檢索標準庫為 NIST11s. LIB 庫。
1.2.2 藥液制備
將乙醇 － 水( 1∶1) 作溶劑將上述 12 種植物精油配置成質量濃度為 200 mg /mL 的母液。
1.2.3 菌株復蘇及菌懸液的制備
將上述 3 種供試菌種進行斜面復蘇，復蘇后接種于固體培養基上，培養 12 ～ 24 h。直接從平板上挑取已純化的單個菌落，混懸于制備好的液體培養基中，制成濃度為 100 萬 ～ 1 億 CFU/mL 的菌懸液，備用。
1.2.4 單體植物精油最小抑菌濃度( MIC) 的測定
用微量二倍稀釋法測定 12 種植物精油的 MIC。首先用 0. 22 μm 濾膜過濾 1. 2. 1 項的藥液母液，作為樣品原液。用制備好的液體培養基依次倍比稀釋，稀 釋 9 個 質 量 濃 度，即質量濃度依次為100. 000、 50. 000、 25. 000、 12. 500、 6. 250、 3. 125、1. 563、0. 781 和 0. 391 mg /mL。將稀釋成不同質量濃度的藥液依次加入微量MIC 測定板中，每孔 0. 1 mL; 分別加入已稀釋好的各種菌液，每孔 0. 1 mL。每種分別設置陽性對照( 加入 0. 1 mL 菌液和 0. 1 mL 液體培養基) 和陰性對照( 只加液體培養基) 。制備好的微量 MIC 測定板于 37 ℃恒溫箱中培養 24 h 觀察結果，完全沒有細菌生長時的最低濃度即為 MIC。
1.2.5 復配植物精油間協同作用的測定
根據單體植物精油 MIC 值，將肉桂醛、香芹酚和百里香酚按一定配比混合，配比和濃度見表 1。
用微量二倍稀釋法測定復配藥液對 3 種致病菌的MIC，再根據公式 1 計算 2 復配成分的部分抑菌濃度( FIC) 以判定它們間的相互作用。當 FIC≤0. 5 時 2 成分表現為協同，0. 5 ＜ FIC≤1 時為疊加，1 ＜FIC ＜ 2 時為不相關，FIC≥2 時為頡頏。
2 結果與分析
2.1 12 種植物精油主要成分分析結果
將 12 種植物精油分別溶于色譜甲醇中即為進樣樣品，按 “1. 2. 1”項 GC － MS 方法進行檢測分析，主要成分及其百分含量見表 2。
2.2 單一植物精油的 MIC 測定結果
12 種植物精油對 3 種致病菌的 MIC 測定結果見表 3。結果表明，在質量濃度 0. 391 ～ 25. 000 mg /mL內，除大蒜油和安息香油外，各植物精油對各致病菌均表現出抑制活性。對于雞大腸桿菌，各精油抑制作用的強弱為牛至油 ＞ 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 丁香油 ＞百里香酚 =百里香油 ＞ 羅勒油 = 山蒼籽油 = 藍桉油 =檸檬草油; 對于雞白痢沙門菌，各精油抑制作用的強弱為牛至油 = 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 百里香酚 = 丁香油 ＞ 百里香油 ＞ 羅勒油 = 山蒼籽油 = 藍桉油 = 檸檬草油; 對于雞金黃色葡萄球菌，各精油抑制作用的強弱為牛至油 = 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 丁香油 ＞ 百里香酚 = 百里香油 ＞ 羅勒油 = 山蒼籽油 = 藍桉油 = 檸檬草油; 因此，牛至油、香芹酚、百里香酚和肉桂醛具有較好的廣譜殺菌活性。從主要成分看，它們主要成 分 分 別 為 76. 8% 香 芹 酚、83. 4% 香 芹 酚、95. 0% 百里香酚和 95. 2% 肉桂醛，因此選擇香芹酚、百里香酚和肉桂醛 3 種精油進行復配研究。
2.3 復配植物精油間協同作用的測定
根據單一植物精油的抑菌結果，選擇效果較好的香芹酚、百里香酚和肉桂醛進行復配，對 3 種致病菌的 MIC 測定結果和 FIC 計算結果見表 4。根據FIC 判定兩復配精油間的相互作用: 對于雞大腸桿菌，各復配組合表現出協同或疊加作用，其中百里香酚和香芹酚濃度比為 1 ∶ 1 復配時協同作用最強( FIC = 0. 28) ; 對于雞白痢沙門菌、香芹酚和肉桂醛復配表現為不相關作用，百里香酚和香芹酚濃度比為 2∶1 復配時協同作用最強( FIC = 0. 41) ; 對于雞金黃色葡萄球菌，只有百里香酚和香芹酚濃度比為2∶1 復配時表現為協同作用( FIC = 0. 37) ，其余復配組合均表現為疊加或不相關作用。綜上所述，百里香酚和香芹酚復配對抑制 3 種致病菌可產生增效。
3 結論
我國植物精油資源豐富，已廣泛應用于醫藥、食品、保健品和化妝品等行業，其作為天然高效的抑菌殺菌物質對革蘭陰性菌和陽性菌均有較強的殺滅作用，因此，植物精油類產品作為抗生素的潛在替代品成為研究熱點。研究 12 種市售植物精油( 羅勒油、大蒜油、山蒼籽油、藍桉油、安息香油、檸檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚) 對 3 種雞源常見致病菌( 大腸桿菌、雞白痢沙門菌和金黃色葡萄球菌) 的抑制作用，在質量濃度 0. 391 ～ 25. 000 mg/mL內，除大蒜油和安息香油外，各植物精油對各致病菌均表現出抑制活性，這與胡艷芬等( 2010) ［4］; 王 改琴等( 2014) ［5］的試驗結果相一致。
總的來說，牛至油、香芹酚、百里香酚和肉桂醛這 4 種植物精油抗菌效果最為明顯，其主要成分分別為 76. 8% 香芹酚、83. 4% 香芹酚、95. 0% 百里香酚和 95. 2% 肉桂醛。不同植物精油的抗菌活性強弱不同，這與其含有的化學組分密切相關。據報道，植物精油組分抗微生物活性大小排序如下: 酚 類( 活性最高) ＞ 肉桂醛 ＞ 醇類 ＞ 醛類 = 酮類 ＞ 酯類 ＞碳氫化合物類［6 － 7］，這與試驗結果相符合。
主要活性成分的抗菌機制已有初步研究。香芹酚和百里香酚互為同分異構體，它們改變了細菌表面蛋白的性質，增加菌體細胞膜的通透性，從而使細胞質中的離子流失及內外水分分配失衡致使細菌細胞死亡［8 － 10］。肉桂醛不影響細胞的結構［11］，其 分子中存在一個醛基，與苯環共軛，具有親核性，易被細菌表面的親水基吸附而穿入細胞壁，破壞細胞壁多糖結構從而產生抑菌或殺菌作用［12］。
對3 種效果明顯的植物精油間的相互作用也進行研究，百里香酚和香芹酚復配后對 3 種致病菌均表現出較強的協同作用，具備開發成為一種復配植物源殺菌劑的潛能。