摘 要：研究三種植物精油及復(fù)配植物精油對腸道主要致病菌生長和顆粒飼料霉變的抑制作用。水蒸氣蒸餾法提純植物精油并復(fù)配，瓊脂打孔擴散法研究單一植物精油和復(fù)配植物精油對腸道主要致病菌福氏志賀氏菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用，濾紙片擴散法、破壞性存放試驗研究單一植物精油和復(fù)配植物精油的防霉作用。結(jié)果顯示：山蒼子精油、肉桂精油和生姜精油組合抑制腸道主要致病菌和霉菌效果最佳( P <0.05)。因此，山蒼子精油、肉桂精油和生姜精油配合使用能有效抑制腸道致病菌，添加到顆粒飼料中能有效抑制霉菌，延長保質(zhì)期。
關(guān)鍵詞：植物精油；抑菌活性；腸道致病菌；防霉；飼料
作者：余行、潘洪彬、程燕東、杜津京、周全江、字玲錦、雷清芝、曹振輝

飼料富含蛋白質(zhì)、淀粉、維生素等營養(yǎng)成分，且結(jié) 構(gòu)疏松、吸濕性強，因此在一定溫度、濕度條件下，微生物易繁殖而發(fā)生腐敗或霉變 [1] 。霉變飼料因霉菌大量繁殖產(chǎn)生霉菌毒素（Mycotoxin），對飼料安全構(gòu)成極大的威脅 [2] ，霉菌毒素可通過食物鏈蓄積并威脅人類健康。Park等 [3] 研究表明，霉菌毒素能夠通過破壞腸道屏障、增加腸道通透性、誘導(dǎo)腸上皮細胞的炎癥反應(yīng)，嚴重損害腸道健康，影響動物生產(chǎn)性能的發(fā)揮。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）估計，全世界每年有數(shù)十億噸糧食、飼料等農(nóng)產(chǎn)品受到霉菌污染 [4] ，給飼料工業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前化學防霉劑主要應(yīng)用于飼料生產(chǎn)，主要分為三類：有機酸防霉劑、有機酸鹽防霉劑和復(fù)合防霉劑。其中有機酸防霉劑主要包括苯甲酸、丙酸、乙酸、富馬酸等，具有防霉效果好的特點，但腐蝕性較大 [5] 。飼料添加化學防霉劑會影響適口性，且因藥物殘留、價格昂貴而不被廣泛采用，與當今及未來對綠色食品的消費需求不符。因此，研發(fā)安全可靠、綠色環(huán)保、功能豐富的飼料防霉劑具有良好的應(yīng)用前景。

植物精油是從芳香類植物或藥用植物的根、莖、葉、花或果實中提取的具有揮發(fā)性的油狀液體，又稱揮發(fā)油，主要成分含有萜烯類及其衍化物、芳香族化合物和含氮、含硫化物等 [6] 。大部分植物精油都有殺菌、抑菌 [7] 、防霉、驅(qū)蟲以及抗氧化 [8] 等功能，被應(yīng)用于食品添加劑、病害防治、殺菌制劑、美容化妝、養(yǎng)生保健等領(lǐng)域。植物精油在動物生產(chǎn)中的相關(guān)研究表明，植物精油對豬、雞、牛等動物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、改善動物腸道健康、增強機體免疫力、提高生產(chǎn)性能等作用 [9-10] ，但對飼料防霉效果鮮見報道。

本試驗選取了三種植物精油并進行復(fù)配，研究其對腸道主要致病菌和霉菌的抑制作用以及在顆粒飼料中的防霉效果，以期為減少常規(guī)獸用抗菌藥物使用及飼料防霉劑的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 植物精油與顆粒飼料
山蒼子精油(Litsea cubeba extraction oil, LCEO)、肉桂精油(Cassia oil, CO)、生姜精油(Ginger essentialoil, GEO)，購自吉安市某天然植物有限公司。肉用仔雞全價配合顆粒飼料，購自昆明某飼料有限公司。日糧組成為：玉米、豆粕、麩皮、石粉、多維、鈣磷、氨基酸、微量元素等。日糧營養(yǎng)水平為：粗蛋白≥21%、粗灰分≤7%、粗纖維≤5%、鈣 0.8%~1.3%、總磷≥0.6%、氯化鈉0.3%~0.8%、水分≤13.8%、蛋氨酸≥0.45%。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備
試劑：無水硫酸鈉、瓊脂、蔗糖、無水乙醇、胰蛋白胨等，均由云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室益生菌資源挖掘與利用課題組提供。培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然）；PDA瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然)；LB肉湯培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 ml、pH值7.2）；LB固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml、pH值7.2）。
儀器設(shè)備：多段可編程培養(yǎng)箱（PGX-2688，寧波東南儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（CS101-2EB，重慶萬達儀器有限公司）；微生物培養(yǎng)箱（DPX-9162，上海福瑪實驗儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法
1.2.1 植物精油復(fù)配
試驗前采用水蒸氣蒸餾法進行植物精油提純。將提純后的植物精油4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min后去除無水硫酸鈉，取上清液，再用0.22 μm的微孔無菌濾膜過濾到棕色瓶，-20 ℃冰箱保存待用。將離心后的三種植物精油按體積比1??1的比例復(fù)配成精油1（山蒼子精油+生姜精油）、精油2（山蒼子精油+肉桂精油）、精油3（生姜精油+肉桂精油），按1：1：1比例復(fù)配成精油4（山蒼子精油+生姜精油+肉桂精油）。

1.2.2 腸道主要致病菌抑制試驗
采用瓊脂打孔擴散法 [11] ，檢測不同精油及其組合對4種腸道主要致病菌生長繁殖的抑制作用。4種菌株37 ℃過夜培養(yǎng)后，吸取20 μl菌液與20 ml溫度為50 ℃的LB固體培養(yǎng)基劇烈混合后傾注平板。無菌條件下用4個內(nèi)徑為8 mm牛津杯打孔，然后在其中3個孔中加10 μl同種精油作為平行試驗組，在第4個孔中加10 μl無菌水作為對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。

1.2.3 霉菌抑制試驗
霉菌分離：將自然霉變的20 g飼料樣品加入到10 ml滅菌生理鹽水中，振蕩得孢子懸浮液，吸取1 ml加入PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d。采用濾紙片擴散法 [12] ，檢測精油對霉菌生長的抑制作用。吸取500 μl、28 ℃過夜培養(yǎng)的霉菌懸液，加入10 ml溫度為50 ℃的PDA瓊脂培養(yǎng)基中迅速混勻后傾注到已用10 ml、2%的瓊脂鋪底的平板中，待培養(yǎng)基液凝固后，將精油浸透的圓形濾紙片放在含菌培養(yǎng)基中央，每組做3個重復(fù)，用無菌水設(shè)置一個空白對照組，放入28 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，待出現(xiàn)抑菌圈后，每天定時測量3組抑菌圈直徑，直至其大小不再變化為止。

1.2.4 飼料破壞性存放試驗
分別稱取肉用仔雞顆粒飼料1 kg置于無菌托盤中，加入1 ml精油，充分攪拌混勻。參照杜莉等 [13] 的方法進行破壞性存放試驗來預(yù)測飼料保存期，即將飼料樣品保存在較高的溫度（25~30 ℃）和濕度（75%~78%）環(huán)境中，將飼料輕度霉變的時間乘以6來預(yù)測飼料在常規(guī)儲存條件下的保存期。具體方法為：在1 L的PVC塑料杯子中部放置一個盛有45 ml水的小塑料杯子，將100 g飼料樣品均勻放置在大杯子中，飼料高度為小杯子高度的一半，然后將大杯子密封，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天定時觀察菌落生長情況并記錄。根據(jù)霉菌菌落生長情況來判定飼料發(fā)霉等級，共分為沒有霉變(表面無霉菌生長)、輕度霉變(表面邊緣有少量霉絲生長)、中度霉變(表面有少量散在霉菌)、重度霉變(表面基本長滿霉菌)、完全霉變(表面霉菌生長茂密)5個等級 [14] 。根據(jù)輕度霉變時間，預(yù)測保存期。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計
試驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行方差分析，均值比較采用Duncan's法。結(jié)果用“平均值±標準差”表示， P <0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析
2.1 植物精油腸道主要致病菌的抑制作用
單一植物精油對主要腸道致病菌的抑制作用如表1所示，與對照組相比，三種單一植物精油均對鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌ETEC10有抑制作用。肉桂精油對鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌的抑制作用顯著高于山蒼子精油（ P <0.05），生姜精油對大腸桿菌K88的抑制作用顯著高于肉桂精油和山蒼子精油（ P <0.05），肉桂精油對大腸桿菌K88的抑制作用顯著高于山蒼子精油（ P <0.05）。
復(fù)配植物精油對主要腸道致病菌的抑制作用如表2所示，與對照組相比，四種復(fù)配精油對鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌 K88、大腸桿菌ETEC10均有抑制作用。精油1、3、4組對鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌K88的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油2組（ P <0.05）；精油1組對福氏志賀氏菌的抑制作用顯著高于精油2、3、4組（ P <0.05），精油3、4組對福氏志賀氏菌的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油 2 組（ P <0.05）；精油 4 組對大腸桿菌ETEC10的抑制作用顯著高于精油1、2、3組（ P <0.05），精油1組和精油3組對大腸桿菌ETEC10的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油2組（ P <0.05）。
2.2 植物精油對霉菌的抑制作用
單一植物精油對霉菌的抑制作用如表3所示，與對照組相比，三種單一植物精油均對霉菌有抑制作用。肉桂精油對霉菌的抑制作用顯著高于山蒼子精油和生姜精油（ P <0.05），山蒼子精油和生姜精油對霉菌的抑制作用差異不顯著。
復(fù)配植物精油對霉菌的抑制作用如表4所示，與對照組相比，四種復(fù)配植物精油均對霉菌有抑制作用。四種復(fù)配植物精油對霉菌的抑菌圈大小順序為：精油2組>精油4組>精油1組>精油3組。

2.3 破壞性存放試驗中植物精油對飼料霉變的抑制作用
破壞性存放試驗結(jié)果如表5所示，在密閉容器中且保持較高的溫度和濕度的條件下，空白對照組在第9 d發(fā)生霉變，添加山蒼子精油、生姜精油的飼料第10 d發(fā)生霉變，添加精油1、3的飼料在第11 d 發(fā)生霉變，添加肉桂精油的飼料在第12 d 發(fā)生霉變，添加精油2、4的飼料在第13 d發(fā)生霉變。因此，添加精油2、4可使飼料預(yù)測保質(zhì)期比空白對照組多24 d，比肉桂精油多6 d，比精油1、3多12 d，比精山蒼子精油、生姜精油多18 d。
3 討論
3.1 植物精油對腸道主要致病菌的抑制作用
大腸桿菌、福氏志賀氏菌和鼠傷寒沙門氏菌是常見的動物腸道致病菌，能引起腸道疾病，影響動物健康，目前多使用抗生素防治。但抗生素的使用導(dǎo)致動物腸道菌群紊亂，耐藥菌株產(chǎn)生，影響畜產(chǎn)品安全。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的精油超過3 000種，其中具有抗菌活性的有1 340多種，約有300余種已經(jīng)被開發(fā)利用 [15] 。山蒼子又稱山雞椒、木姜子、山姜子，樟木科姜子屬，其果實、根、葉、花等部位均可用于提取精油，山蒼子精油主要是從果實中提取 [16] 。山蒼子精油具有抗氧化、抗菌和抗炎作用 [17] 。Nguyen等 [18] 研究山蒼子精油對病原菌抗菌活性的結(jié)果表明，山蒼子精油有較強的殺菌作用，通過改變細胞形態(tài)，破壞細胞膜完整性、通透性，改變類核形態(tài)抑制大腸桿菌生長。She等 [19] 研究表明從7月份山蒼子中提取的精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌均有抑制活性。本研究中，山蒼子精油對大腸桿菌ETEC10的抑菌效果與肉桂精油和生姜精油相當（ P >0.05），對鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌的抑制效果與生姜精油抑菌效果相當（ P >0.05）。肉桂也稱中國肉桂，是樟科植物樟屬肉桂的干燥樹皮，含豐富的揮發(fā)油 [20] 。Clemente等 [21]對芥菜和肉桂精油聯(lián)合抑菌研究，發(fā)現(xiàn)兩種精油都能穿過細菌細胞膜，通過作用于細胞靶點發(fā)揮殺菌作用。Amin等 [22] 采用圓盤擴散法研究不同精油對沙門氏菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)肉桂精油和百里香精油抑菌活性最高，抑菌直徑為22.5 mm和38.5 mm，這與本試驗中肉桂精油對沙門氏菌抑制效果顯著( P <0.05)的結(jié)果具有相同之處。生姜是姜屬植物的新鮮根莖，有百辣辛等名 [23] 。生姜精油是從生姜根莖中提取，呈淺黃或橘黃色，透明且可流動的揮發(fā)性成分，具有特殊的香味 [24] 。Hossain等 [25] 研究生姜精油對比目魚致病菌體外抗菌作用，發(fā)現(xiàn)生姜精油對從比目魚中分離的 Edwardsiel?la tarda 、 Photobacterium damselae 等5株革蘭氏陰性菌和 Lactococcus garvieae 、 Streptococcus iniae 、 Strepto?coccus parauberis 等 9 株革蘭氏陽性菌均有抑制作用。Kavas等 [26] 研究表明添加1.5%生姜精油可以改善食用包衣的抗菌效果，能減少貯藏過程樣品中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌數(shù)量。趙露露等 [27] 研究10 種具有較強抑菌作用的植物提取物及其復(fù)配物對雞源致病菌（雞大腸桿菌和雞沙門氏菌）的抑制作用，結(jié)果表明肉桂精油、苦參堿、綠原酸對雞源致病菌有抑制作用，兩兩復(fù)配或三種植物提取物復(fù)配后對大腸桿菌的抑制作用并未優(yōu)于單一肉桂精油，本研究中由肉桂精油和山蒼子精油復(fù)配的精油2組對鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌ETEC10和大腸桿菌你K88的抑制效果不如單一的肉桂精油和山蒼子精油，其原因可能是肉桂精油與山蒼子精油對以上常見腸道致病菌的抑菌機制相同，兩者復(fù)配沒有發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。

3.2 植物精油對霉菌的抑制作用，以及對顆粒飼料保質(zhì)期的影響
飼料發(fā)生腐敗或霉變是由微生物大量繁殖引起，霉菌是這類微生物的主體。霉菌毒素是指霉菌在其污染的谷物或飼料中所產(chǎn)生的一類有毒的次級代謝產(chǎn)物，對畜禽養(yǎng)殖業(yè)及飼料工業(yè)的發(fā)展造成嚴重影響 [28] ，主要有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和伏馬毒素等。黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的次級代謝物，包括B1、B2、M1、M2等20種類型，黃曲霉毒素B1毒性最強，有致癌、致畸和致突變等作用，對人和畜禽健康危害極大 [29] 。玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素，是一種雌激素類霉菌毒素，主要危害動物生殖系統(tǒng)，降低動物的繁殖性能 [30] ，禾谷鐮孢菌是其主要產(chǎn)毒菌株。嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，是禾谷鐮刀菌等糧食病原菌的次級代謝物 [31] ，能引起腸道病變，改變腸道屏障 [32] ，產(chǎn)生免疫毒性 [33] ，危害人和動物的健康。伏馬毒素主要由串珠鐮刀菌和多育鐮刀菌產(chǎn)生的一類有不同多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯水溶性化合物，主要有伏馬毒素B1、B2和B3等 [34] ，具有神經(jīng)毒性、器官毒性、免疫毒性、致癌性等有害作用，嚴重危害人畜健康 [35] 。有研究表明，霉菌毒素能降低豬的生長性能、免疫功能和繁殖性能 [36] 。飼料的防霉是保障飼料衛(wèi)生質(zhì)量安全的重要措施。研究表明天然植物精油能夠抑制霉菌生長。Horváth等 [37] 以白色念珠菌、近平滑假絲酵母、煙曲霉菌、土曲霉菌、小孢根霉菌、鐮刀菌和傘枝梨頭霉為研究對象，研究肉桂精油、香茅精油、丁香精油、薄荷精油和百里香精油抗酵母和抗霉菌活性，結(jié)果表明百里香精油、肉桂精油和丁香精油組合抗真菌活性最強。Suhem等 [38] 研究發(fā)現(xiàn)氦-氖激光處理的山蒼子精油對黃曲霉的抑制活性提高80%，能完全抑制自然放置的糙米生長霉菌至少25 d，沒有經(jīng)精油和激光處理的糙米在 3 d 內(nèi)觀察到霉菌污染。Gómez等 [39] 研究在不同環(huán)境條件下，牛至精油和肉桂精油及其主要活性成分香荊芥酚和肉桂醛對玉米提取液中黃曲霉毒素的抑制作用，結(jié)果表明精油及其主要成分對真菌生長和黃曲霉毒素產(chǎn)生有抑制作用。鄔本成等 [40] 研究肉桂醛和香芹酚等組成的復(fù)合植物精油對青霉、黑曲霉和根霉的抑菌作用，并以添加不同水平植物精油（0、100、200、300 mg/kg）飼料發(fā)生霉變的時間估計精油在飼料防霉方面的功效，結(jié)果表明，植物精油能有效抑制青霉菌和黑霉菌的生長，飼料中添加植物精油不能明顯延長其保存時間。本研究結(jié)果表明，單一植物精油和復(fù)配植物精油均能有效抑制霉菌的生長，極端試驗結(jié)果顯示，植物精油添加到顆粒飼料中能不同程度的延長顆粒飼料的保質(zhì)期。

4 結(jié)論
山蒼子精油、肉桂精油和生姜精油等體積復(fù)配，能有效抑制主要腸道致病菌、霉菌的生長，按1‰比例添加到顆粒飼料中能延緩發(fā)霉時間，延長顆粒飼料的保質(zhì)期。

參考文獻略