作者：謝 強，林玉桓，苗淑萍，李 晶，夏秀華
摘 要: 研究香芹酚對革蘭氏陰性菌大腸桿菌( ATCC 8735) 和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌( ATCC 3101) 的形態、細胞膜的完整性與通透性的影響。結果表明: 與對照組相比，經香芹酚處理后的樣品組具有較高的紫外吸光值、電導率值和酶活力。隨著香芹酚作用時間的延長，實驗組的紫外吸光值、電導率值和酶活性均有快速的增加，并達到一個相對穩定的狀態。同時，掃描和透射電鏡圖顯示，經香芹酚作用 6～8h 后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態均有明顯改變。香芹酚在最低抑菌濃度( MIC 0.31mg/mL) 作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，能夠破壞菌體細胞膜和細胞壁的完整性、并引起細胞膜通透性和菌體形態的改變。
關鍵詞: 香芹酚，細菌細胞膜，完整性，通透性，形態結構

香芹酚( 2－甲基－5－異丙基苯酚) ，是牛至和百里香等植物精油的主要成分［1］ 。近年來，香芹酚的菌活性受到了極大的關注［2－6］ ，并在美國和歐洲被批準為安全食品添加劑［7－8］ 。研究發現，香芹酚對細菌、酵母菌、真菌、昆蟲及螨類均具有良好的生長抑制作用［9－12］ 。本課題前期的研究發現，香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的 MIC ( 最低抑菌濃度) 均為0.31mg/mL［13］ 。然而，香芹酚的抑菌活性機理尚且缺乏系統研究［2］ 。有研究認為 ［14］ ，作用于細胞膜可能是單萜類化合物、苯丙烯和相關含氧化合物發揮抑菌作用的重要機制，因為微生物的脂質成分在環境中化學物理特性發生改變的情況下會發生較大的變異［15－16］ ，而在應對外部干擾時，細胞膜脂質的變異又對維持細胞膜的流動性、完整性和功能性有著重要作用［17］ 。所以，微生物脂質成分的變化可能導致細胞膜物理特性的變化，并可能在影響細胞膜的滲透性方面發揮重要作用［18］ 。因此，本實驗旨在研究香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞膜的影響。通過檢測香芹酚處理后菌懸液的紫外吸收和電導率研究香芹酚對細菌細胞膜完整性的影響; 結合檢測β－半乳糖苷酶活力探討香芹酚對細菌細胞膜通透性的影響; 并采用掃描電鏡和透射電鏡技術觀察香芹酚對細菌形態的影響。

1 材料與方法
1.1 材料與儀器
香芹酚( 98% ) 、鄰硝基苯－β－D－吡喃半乳糖苷( ONPG) Sigma－Aldrich 公司; 大腸桿菌、金黃色葡55萄球菌 吉林大學人獸共患病研究所。
UV－2550 紫外可見分光光度計 日本島津公司; DDSJ－308A 電導率儀 上海雷磁儀器廠有限公司; ES－2030 真空冷凍干燥機、E－1010離子濺射儀、S－3400N掃描電子顯微鏡、H－7650 透射電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 實驗方法
1.2.1 菌懸液紫外吸收的測定 
在 Cooper 等［19］ 實驗方法的基礎上，實驗操作如下: 取對數生長期大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌液，5000r/min 離心 10min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖溶液( PBS，pH 7.4) 洗滌三次后重新懸浮，使菌懸液 A 630nm = 0.5 ± 0.02。根據之前的研究結果，香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的 MIC 均為 0.31mg/mL ［13］ ，設計三個香芹酚濃度梯度。用香芹酚溶液與稀釋好的菌液按照不同體積混合，使香芹酚最終濃度分別為 MIC( 0.31mg/mL) 、2MIC( 0.63mg/mL) 和 4MIC( 1.25mg/mL) ，然后放置于( 37 ±1) ℃搖床中分別培養 0、1、2、4、6 和 8h。將樣品經 0.22μm 濾膜過濾，濾液用紫外分光光度計于260nm 處測定吸光值(A260nm) ，以不加香芹酚的菌懸液為空白對照，每個樣品重復三次。
1.2.2 菌懸液電導率的測定 
根據 Lee 等［20－21］ 的實驗方法，利用電導率儀對培養液中電解質的檢測，可以用來探究細胞內容物的外溢情況。取對數生長期大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌懸液，5000r/min 離心10min，收集菌體，用 0.85% NaCl 洗滌三次后重新懸浮，使菌懸液 A 630nm = 0.5 ± 0.02，之后，加入香芹酚及進行培養的操作與紫外吸收測定部分一致。各時間點取 5mL 菌液，10000r/min 離心 15min，取上清液測定菌懸液電導率。以不加香芹酚的菌懸液作為空白對照，每個樣品重復三次。
1.2.3 菌懸液中 β－半乳糖苷酶活力的測定 
通過以 ONPG 為底物對大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌懸液中 β－半乳糖苷酶活性的測定，可以探究細胞膜的通透性［22－23］ 。取對數生長期大腸桿菌或金黃色葡萄球菌 菌 懸 液，5000r/min 離 心 10min，收 集 菌 體，0.05mol/L NaH 2 PO 4 磷酸緩沖液洗滌三次重新懸浮，使菌懸液 A 600nm 約為 0.2。之后加入香芹酚及進行培養的操作與紫外吸收測定部分一致。各時間點立取10mL，10000r/min 離 心 15min，離 心 后 取 上 清 1mL，加 入 4mL 0.05mol/L ONPG，37℃ 水 浴 反 應40min，然后加入 0.5mol/L Na 2 CO 3 5mL 終止反應，420nm 下 比 色。實 驗 重 復 三 次。酶 活 力 計 算 公式為:
β－半乳糖苷酶活力單位( U/mL) = ( OD 420 × A) /( B × C ×0.0045)
其中: A 是反應混合液體積( mL) ，5mL; B 是反應時間( min) ，40min; C 是樣品體積( mL) ，10mL;0.0045( mL/n mol) 是消光系數。
所以:β－半乳糖苷酶活力單位( U/mL) = OD 420 ×2.7781.2.4 掃描電鏡觀察 取對數生長期的菌體，用多聚賴氨酸包被 10h，再用 MIC 的香芹酚作用 6～8h，PBS 洗滌 3 次后，用 2.5% 的戊二醛于 4℃ 固定 2h。
PBS 緩沖液洗滌 3 次，每次 15min，之后用鋨酸于 4℃固定 30min。樣品經乙醇脫水，再用真空冷凍干燥機進行干燥，經離子濺射儀進行離子噴金后，最后通過掃描電子顯微鏡觀察。以未經香芹酚處理的菌體作為空白對照，實驗重復三次。
1.2.5 透射電鏡觀察 
對數期生長的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，于濃度為 MIC 的香芹酚作用6～8h。8000r/min 4℃離心 15min，并用 PBS 洗滌 2～3次，收集菌體，用 4% 的戊二醛于 4℃ 固定 24h，PBS洗滌 3 次，每次 15～45min。樣品經梯度脫水、包埋劑包埋 3h、超薄切片和醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛分別染色 10min，最后進行透射電鏡觀察。以未經香芹酚處理的菌體作為空白對照，實驗重復三次。

2 結果與討論
2.1 香芹酚對細菌細胞膜完整性的影響
細胞內容物是否外溢是細胞膜是否完整的標志。當細胞膜遭到破壞時，胞內的一些磷酸鹽、碳酸鹽、DNA 與 ＲNA 等均會先后從細胞膜中釋放出來，而這些核內物質在 260nm 處有很強的紫外吸收［25］ ，同時，菌懸液中電解質增加，其電導率也會增加。因此，可以通過檢測菌懸液的紫外吸收和電導率的變化情況來推測菌體細胞膜完整性的變化。
2.1.1 紫外吸收測定 
香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的菌懸液紫外吸光值( 以下用 A 260nm代替) 隨時間的變化情況見圖 1。結果表明，隨著時間的延長，經香芹酚作用后的兩種菌懸液的 A 260nm 變化均為先快速增長后達到相對穩定狀態。然而，可能由于革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌沒有細菌外膜［19］ 的原因，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的結果存在一些差異。如圖1a 所示，對大腸桿菌而言，香芹酚作用的實驗組的 A 260nm 在 2～4h 有明顯的增長，MIC、2MIC 和 4MIC 的香芹酚劑量組在 4h 的 A 260nm 分別為0.286 ±0.0089，0.409 ± 0.0113 和 0.627 ± 0.0162，均明顯高于空白對照組 0.163 ± 0.0087。與大腸桿菌不同的是，香芹酚作用下的金黃色葡萄球菌菌懸液的 A 260從初始時間就快速增長并于 1h 后達到平穩期( 圖1b) 。對照組及 MIC、2MIC、4MIC 的香芹酚劑量組在1h 的 A 260 分別為 0.221 ± 0.0121，0.342 ± 0.0235，0.474±0.0089，0.783 ±0.0132。
由圖 1 可以看出，香芹酚濃度不同，菌懸液起始的紫外吸收值不同，可能是由于香芹酚濃度不同，引起的吸收不同所致，且兩種菌菌懸液的紫外吸收值隨著香芹酚濃度的增加而增加。此外，與大腸桿菌不同的是，金黃色葡萄球菌對照組的紫外吸收值隨著時間的延長有緩慢的增加，同時，MIC、2MIC 香芹酚作用的金黃色葡萄球菌劑量組相比于對照組的變化沒有 4MIC 香芹酚劑量組明顯，這可能與金黃色葡萄球菌對香芹酚的藥敏性有關。
Chen 和 Cooper ［19］ 研究表明，鉀離子的外溢與菌體的生長抑制有關，無機磷酸鹽和 260nm 吸光物的釋放與抑菌劑的殺菌活性有關。此結果中，兩種菌菌懸液的紫外吸收值隨著香芹酚濃度的增加而增加，這說明，香芹酚的濃度越高，相同時間與條件下菌懸液中紫外物質積累越多，香芹酚對細菌細胞膜的完整性破壞越嚴重。
2.1.2 電導率測定 
濃度為 MIC、2MIC 和 4MIC 的香芹酚作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后，菌懸液的電導率變化見圖 2。對于大腸桿菌( 圖 2a) ，在濃度為 MIC 和 2MIC 的香芹酚作用下，菌懸液的電導率不僅高于對照組而且在 0～2h 內有明顯增加，同時2MIC 香芹酚劑量組的電導率值高于 MIC 香芹酚劑量組，MIC 和 2MIC 香芹酚劑量組在 2h 的電導率值分別為 9.347 ± 0.0196、9.837 ± 0.0258μs/cm。然而，4MIC 香芹酚劑量組的大腸桿菌菌懸液的電導率隨著時間延長增長趨勢較緩慢，這可能是由于前面提到的離心分離步驟中菌體外溢物對沉淀物有吸附的原因，致使在電導率測定前外溢物被離心分離掉。對于金黃色葡萄球菌( 圖 2b) ，在濃度為 4MIC 的香芹酚作用下，菌懸液的電導率明顯高于對照組，且在0～1h 內有明顯增加，在 1h 的電導率值為 11.074 ±0.0518μs/cm，之后電導率也趨于穩定狀態。與紫外吸光度實驗結果想似的是，MIC、2MIC 香芹酚作用的金黃色葡萄球菌劑量組相比于對照組的變化同樣沒有4MIC 香芹酚劑量組明顯，原因同紫外吸收部分。
綜上可以發現，經香芹酚處理后，菌懸液中紫外吸收和電導率均有不同程度增加。可見香芹酚對兩種菌體細胞膜的完整性產生了不同程度的影響。且在同樣的作用時間和條件下，一定濃度范圍內，香芹酚的濃度越大，影響越明顯。

2.2 香芹酚對細菌細胞膜通透性的影響
β－半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶等均屬于膜內物質，正常情況下不會分泌到細胞外，但當細胞膜受到破壞時，胞內部分酶會泄漏到細胞外。因此，菌液中 β－半乳糖苷酶的酶活性可以作為表征細胞膜通透性是否發生變化的一個參數[25]。
在 2h，經濃度為 MIC、2MIC 和 4MIC 的香芹酚作用后，大腸桿菌菌懸中 β－半乳糖苷酶的酶活力分別為0.558 ± 0.0042、0.575 ± 0.0051、0.614 ± 0.0068U/mL，明顯高于對照組( 0.419 ± 0.0031) U/mL; 金黃色葡萄球菌菌懸液中 β－半乳糖苷酶的酶活力分別為 0.528 ±0.0058，0.544 ± 0.0055、0.542 ± 0.0064U/mL，同樣明顯高于對照組( 0.264 ±0.0025) U/mL。
大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液的 β－半乳糖苷酶的酶活力變化存在一些差異。從圖3a 可以看出，大腸桿菌菌懸液的酶活力在 0～1h 快速增加，在1～2h增長速度相對緩慢; 而從圖 3b 來看，金黃色葡萄球菌菌懸液的酶活力在1～2h 快速增加，卻在0～1h相對緩慢。這可能仍與兩種菌的結構不同有關。
以上結果表明，菌體經香芹酚作用后，隨著時間的增加，菌懸液中 β－半乳糖苷酶的酶活力增加。可以推斷，細胞內 β－半乳糖苷酶逐漸從胞內流出，香芹酚影響了細菌細胞膜的通透性。

2.3 香芹酚對細菌微觀形態影響

2.3.1 掃描電鏡下細菌的形態分析 

香芹酚加入前后菌體的掃描電鏡結果如圖 4 所示。對照組中( 圖4a 和圖 4c) ，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均呈具有光滑 細 胞 膜 的 正 常 形 態。然 而，經濃 度 為 MIC( 0.31mg/mL) 的香芹酚作用后，兩種菌在形態上發生了較大的改變。大腸桿菌主要表現為附有顆粒的粗糙細胞膜、伴有黏性物質的粘連狀態和幾乎溶解的菌體; 金黃色葡萄球菌主要表現為具有大量黏膜的粘連狀態和褶皺的細胞膜。

由結果可知，相對于金黃色葡萄球菌，香芹酚對大腸桿菌的形態有著更大的影響。Eaton 等認為［26］ ，作為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌具有外膜而且生物膜很可能是香芹酚的作用目標，所以此結果可以算是在意料之中; Ceylan 等也曾報道［27－29］ ，革蘭氏陰性菌對植物精油的耐藥性要強于革蘭氏陽性菌，Storia 認為［3］ ，細胞表面結構的改變是菌體對外界壓力的適應性反應的表現，即作為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌因為耐藥性強所以才表面形態改變較大。
此外，在香芹酚作用下，大腸桿菌的細胞膜變得粗糙且具有顆粒物，由此推測，香芹酚可能使更多的成分暴露于外膜( 如蛋白質和脂質) ，從而導致表面粗糙度增加; 而金黃色葡萄球菌則表現為細胞膜更加的褶皺，以此可以假設，香芹酚穿過了肽聚糖然后作用在細胞質膜，Storia 等認為［3］ ，金黃色葡萄球菌細胞質膜結構的改變，如流動性，可能只是引起細胞膜表面微小的變化。
Moosavy 等認為［30］ ，嚴重的形態損傷和膜破壞會增加菌體對細胞內容物的通透性。所以，此處香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體形態的影響的結果與紫外吸收測定、電導率測定及 β－半乳糖苷酶活性測定的結果均是一致的。

2.3.2 透射電鏡下細菌的形態分析 
香芹酚加入前后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的透射電鏡結構如圖5 所示。與對照組相比( 圖 5a 和 5c) ，香芹酚作用的菌體均形態異常( 圖 5b 和 5d) 。最突出的表現有細胞壁和細胞膜的溶解、細胞內容物的外溢以及由于異常蛋白沉淀而出現的內容物固縮［31］ 。此外，大腸桿菌中還出現了質壁分離與缺失內容物的空腔現象; 金黃色葡萄球菌中還出現了細胞內容物的極化現象。電鏡結果可知，香芹酚可能作用于菌體的不同部分，所以香芹酚的抑菌作用機制可能存在不同的作用方式。
3 結論
本研究結果表明，香芹酚在最低抑菌濃度( MIC0.31mg/mL) 作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，能夠破壞菌體細胞膜和細胞壁的完整性、并引起細胞膜通透性和菌體形態的改變。由此推測，香芹酚的抑菌機制可能與它的理化特性相關。香芹酚可能作用于細胞膜，導致細胞膜特性的改變，以此影響整個菌體生長; 也可能進一步穿過細胞膜，進入細胞內部并與細胞內的抑菌活性位點作用，以此抑制菌體活性。對于香芹酚如何進入菌體細胞內，如何與菌體發生作用，以及其遺傳大分子的影響有待更多的基礎研究。