摘要: 乳房炎是奶牛乳腺的炎癥反應，與產奶量降低和牛奶質量變化直接相關，被公認為是乳制品行業成本最高的疾病之一。由于常用的抗生素治療存在諸多安全隱患，迫切需要尋找防治奶牛乳房炎的新方案。植物來源的生物活性化合物，不僅低毒無殘留，而且能有效抑制乳房炎病原微生物，緩解奶牛乳房炎的炎癥反應和改善泌乳功能，成為近年來 奶牛乳房炎防治領域的研究熱點。因此，本文就植物提取物對奶牛乳房炎的影響及作用機制進行綜述，為植物提取物的開發利用及奶牛乳房炎的有效控制提供參考依據。
關鍵詞: 植物提取物  乳房炎  奶牛  抗菌  抗炎 泌乳  作用機制
作者：宋潔, 胡耀, 敖長金 , 王麗芳  轉自：動物營養學報

乳房炎是全球公認的發病率最高的奶牛疾病, 是乳腺實質在受到各種病原菌侵襲及理化因素刺激下所發生的炎癥反應。乳房炎能夠導致牛奶產量和質量降低, 奶牛淘汰率和死亡率增加, 給乳制品行業帶來了巨大的經濟損失[1]。乳房炎分為隱性乳房炎和臨床乳房炎, 其中隱性乳房炎無明顯癥狀, 臨床乳房炎會導致奶牛乳房顯著病變, 呈紅色、腫脹、發熱、疼痛[2]?？股厥悄壳爸委熌膛Ｈ榉垦椎氖走x藥物, 但長期濫用抗生素會導致病原菌耐藥性和抗生素殘留問題, 嚴重危害人類健康[3]。歐洲立法機構從2003年就開始停止將抗生素作為飼料添加劑使用。美國自2017年起要求獸醫使用抗生素必須獲得許可[4]。因此, 急需新的療法預防和治療乳房炎。植物提取物是植物在發育過程中天然產生的次生代謝產物, 包括多酚、精油、生物堿、皂苷、多糖等活性物質[5-6], 具有不易產生耐藥性、體內代謝快、低毒無殘留等優點, 以及抗菌、抗氧化、抗炎等功效, 是理想的抗生素替代物[7]。盡管植物提取物在奶牛乳房炎的防治中有突出療效, 但是相關機制研究報道有限。因此, 本文綜述了植物提取物對乳房炎致病菌、炎癥反應和奶牛泌乳功能的影響, 為植物提取物的開發及奶牛乳房炎的有效控制提供參考依據。
1 植物提取物對奶牛乳房炎致病菌的影響及其機制
由病原微生物引起的奶牛乳房炎分為傳染性和環境性2類。其中傳染性乳房炎致病菌來源于受感染奶牛的乳腺, 通常是擠奶時在奶牛間傳播, 主要包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、支原體和牛棒狀桿菌等。環境性乳房炎致病菌來源于奶牛生活的環境, 主要包括大腸桿菌、克雷伯氏菌、停乳鏈球菌等[8], 其中最常見的是革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌。

植物提取物體內外抗菌活性是防治奶牛乳房炎研究中的一項重要指標。植物提取物有效成分, 如生物堿、精油、多酚、多糖、有機酸等均具有不同程度的體內外抗菌作用[9]。近年來研究表明, 在眾多植物提取物中, 精油和多酚類化合物具有顯著的抗菌效果, 是常用的"新型抗菌劑"[10-11]。Shafi等[12]對感染葡萄球菌、鏈球菌和棒狀桿菌乳房炎的奶牛進行治療, 每日口服600 mg/kg體重的圣羅勒葉粉, 第14天時, 可以顯著消除奶牛乳房內69.23%的細菌感染, 其中發揮抗菌作用的活性成分主要為精油(丁香酚80%)、黃酮類和三萜等。Gomes等[10]通過藥敏試驗對比了茴香、藍桉、胡桃提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果, 其中藍桉提取物最有效, 抑制圈直徑在8.0~15.0 mm變化, 最低抑菌濃度(MIC)最小, 為0.19~0.39 mg/mL, 亞抑菌濃度(1/2MIC)可降低所有測試菌株活力的65%~85%, 而高抑菌濃度(2×MIC)足以完全抑制金黃色葡萄球菌的生長, 其中主要活性成分為沒食子酸、鞣花酸苷和槲皮素衍生物等酚類化合物。Kher等[8]采用瓊脂擴散法進行體外抑菌試驗表明, 訶子乙酸乙酯提取物中的酚類抑菌作用明顯, 當添加濃度為500 μg/mL時, 對乳房炎致病菌生長的抑制作用表現為巨大芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>銅綠假單胞菌>大腸桿菌, 具有與阿莫西林同樣的體外抑菌效果。因此, 植物提取物具有天然的廣譜抗菌活性, 可以替代抗生素治療奶牛乳房炎, 對于奶牛養殖業的健康發展具有重要意義。

植物提取物能直接作用于乳房炎致病菌, 抑制其生長繁殖, 減弱其致病性, 甚至直接殺滅病原菌, 從而達到防治乳房炎的效果。其主要殺菌機制如下:1)破壞細菌細胞膜。細胞膜的破壞導致細胞破裂, 核酸和蛋白質等內容物外泄喪失, 最終導致細菌死亡。2)降低ATP酶活性。細菌中5種典型的ATP酶包括Ca2+/Mg2+-ATP酶、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶, 植物提取物通過降低ATP酶活性, 影響細菌Ca2+轉移以及Na+/K+離子交換, 導致其無法維持正常細胞壁通透性和細胞膜內外滲透壓, 造成細菌死亡。3)影響細菌能量供應。β-半乳糖苷酶能催化乳糖水解成單糖, 是微生物能量的主要供應者。植物提取物通過抑制細菌β-半乳糖苷活性阻礙細菌能量供應。4)抑制細菌呼吸代謝。植物提取物
可降低微生物葡萄糖分解代謝磷酸己糖途徑(HMP)中的關鍵調節酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)活性, 抑制細菌呼吸代謝速率。5)改變遺傳信息結構。植物提取物可與細菌DNA形成嵌合體, 改變DNA分子結構, 抑制細菌生物活性[13-14]。6)避免細菌黏附和生物膜形成。植物提取物防止生物膜阻礙宿主免疫系統和抗菌治療, 導致持久感染[15]。7)減弱細菌致病力。植物提取物通過抑制細菌毒力因子編碼基因的轉錄減少毒力因子的分泌[16]。綜上可知, 植物提取物主要從細胞結構、細胞內生物大分子功能、呼吸代謝途徑等方面抑制乳房炎致病菌活性, 但不同類別和濃度的植物提取物在治療過程中是否會抑制乳房炎奶牛瘤胃、腸道和乳腺中有益菌的生長繁殖及其機制有待進一步研究。

2 植物提取物對奶牛乳房炎炎癥反應的影響及其機制
乳房炎被定義為乳腺內的感染和炎癥, 適當的炎癥反應有助于消除感染, 但過度的炎癥反應將導致組織和細胞損傷。乳腺中的免疫細胞和非免疫細胞都具有模式識別受體(PRR), 可以與微生物群體特有的多種病原體相關分子模式(PAMPs)相互作用, 從而激活乳腺炎癥反應期間的免疫應答過程。PRR成員Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)屬于跨膜蛋白家族, 其中的TLR2和TLR4對乳腺防御尤為重要, 能識別與革蘭氏陽性和革蘭氏陰性乳房炎病原菌相關的PAMPs, 如肽聚糖(PGN)和脂多糖(LPS)[17], 并進一步通過髓樣分化因子8(MyD88)信號傳導[18], 激活細胞核2種主要炎癥信號通路:核轉錄因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)途徑和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)途徑, 進而誘導涉及免疫和炎癥反應的多種基因表達, 包括介導炎癥過程的重要酶, 如誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環氧合酶(COX-2)基因表達, 以及幾種關鍵的炎性細胞因子, 如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6和IL-1β等基因表達[19], 導致炎癥級聯反應的發生。此外, 炎性細胞因子會加速活性氧(ROS)的積累并破壞抗氧化防御機制, 引發氧化應激, 導致炎癥反應加劇[20]。

存在于天然植物提取物中的多酚、皂甙、生物堿、精油等活性成分均具有免疫調節和抗炎特性, 能夠顯著減少乳房炎奶牛體細胞含量, 抑制炎性因子分泌, 增強免疫調節功能, 從而有效降低奶牛乳房炎發病率[21-23]。植物提取物的抗炎作用由復雜的細胞機制介導, 其中主要與抑制炎癥信號通路關鍵蛋白磷酸化, 進而阻斷NF-κB和MAPKs信號途徑活化有關。炎癥中樞調節劑NF-κB蛋白主要作為p50和p65的異源二聚體存在。當炎癥刺激后, IκB激酶(IKK)被激活并引起核因子κB抑制蛋白(IκB)的磷酸化, 導致NF-κB的釋放和核轉位, 并啟動促炎因子基因的轉錄[19]。研究表明, 植物精油如香精油、茶樹油、香樟油和桉樹油能顯著下調NF-κB信號通路中的關鍵因子p65和p50以及IL-1β、IL-8、TNF-
α mRNA的表達量, 從而抑制LPS誘導的乳腺炎癥反應[24]。MAPKs信號通路包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N terminal kinase, JNK)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)和p38激酶, 在炎癥反應中也起著至關重要的作用。羥基酪醇對金黃色葡萄球菌誘導的乳房炎具有顯著保護作用。不僅能減少巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤, 維持乳腺組織的結構完整性, 同時能劑量依賴性地下調乳腺上皮細胞TLR2的表達, 抑制IκBα和p65的磷酸化, 并降低JNK、ERK和p38激酶的磷酸化水平, 減少促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌, 以減輕乳腺組織炎性損傷[25]。植物提取物可以作用于與炎癥相關的多種信號傳導途徑, 是奶牛乳房炎的有效治療劑, 未來還需要進一步研究與植物提取物抗炎作用相關的其他可能的途徑和靶標。

此外, 植物提取物的抗氧化特性也有助于其發揮抗炎作用。機體內過量的ROS及一氧化氮(NO)是誘發細胞氧化損傷和乳房炎等疾病的重要原因之一。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2)是一種氧化還原敏感的轉錄因子, 可刺激抗氧化酶的轉錄, 有助于消除ROS。植物多酚能直接或通過誘導Nrf2活化清除ROS, 從而避免氧化應激通過激活NF-κB和MAPKs途徑促發炎癥反應[26]。Li等[19]研究發現, 黃芪素能夠顯著抑制LPS處理下iNOS和COX-2的活化, 減少NO大量產生, 并能有效減少LPS誘導的乳腺上皮細胞TLR4表達、NF-κB活化、IκBα降解、p38磷酸化以及TNF-α和IL-6表達。丙二醛(MDA)是衡量氧化損傷的重要指標。Hu等[20]研究表明, 白薇提取物白薇甙能通過減少
MDA含量顯著緩解LPS誘導的乳腺組織病理學變化和乳腺氧化應激損傷, 并通過阻斷TLR4的表達, 抑制NF-κB及MAPKs信號通路中關鍵蛋白磷酸化, 防止在感染過程中進一步加重炎癥免疫反應。因此, 利用植物的抗氧化功能來防止氧化應激的發生為奶牛乳腺炎治療提供了另一個方案。

3 植物提取物對乳房炎奶牛泌乳功能的影響及其機制
牛奶產量和質量與乳房狀態有關, 只有健康的乳房才能產生成分正常的牛奶。乳房炎直接導致奶牛乳腺組織炎癥損傷, 影響奶牛乳腺分泌功能, 從而造成牛奶產量的降低及乳成分的改變。乳房炎奶牛個體的病變程度隨感染階段和持續時間而變化, 嚴重時會造成血液成分滲入牛奶, 而正常牛奶組分含量減少, 當疤痕或結締組織取代了泌乳組織, 將導致奶牛永久喪失泌乳能力[27]。研究表明, 多酚、多糖和有機酸等植物提取物能夠明顯提升乳房炎奶牛泌乳功能。Olagaray等[28]發現黃芩提取物中的黃酮類化合物能增強奶牛泌乳適應性, 與對照組相比, 黃芩提取物使用60 d顯著降低了奶牛體細胞數量和乳房炎的發病率, 乳脂肪、乳蛋白和乳糖含量明顯增加; 黃芩提取物使用305 d全期泌乳量顯著增長13%, 表明乳腺健康狀況得到改善。姚櫓等[29]研究表明, 杜仲提取物含有綠原酸、珊瑚苷、多糖及黃酮類等多種活性成分, 給隱性乳房炎奶牛每天灌服20 g杜仲提取物, 能夠顯著提升試驗第12天牛奶中乳脂率和乳糖率。Sunder等[27]給患有亞臨床乳房炎的奶?？诜耐墓麑嵦崛∥? 乳房炎奶牛牛奶成分發生積極變化, 乳中pH、電導率均顯著降低, 產奶量有增加的趨勢。

植物提取物對乳房炎奶牛泌乳功能的作用機理可能包括以下幾個方面。1)通過促進乳腺上皮細胞增殖提升泌乳功能。乳腺上皮細胞是奶牛哺乳期分泌乳汁的主要場所, 也是乳腺組織面對病原菌侵襲的第1道防線。乳房炎導致乳腺組織損傷, 乳腺上皮細胞數量和活性降低, 直接造成奶牛產奶量下降[30]。孟云[31]研究發現, LPS組奶牛乳腺上皮細胞受損, 處于遺傳物質儲備和細胞分裂關鍵階段的S、G2和M期細胞數量顯著降低, 出現細胞核碎裂、染色質固縮及DNA斷裂, 從而導致細胞凋亡; 添加黃芪多糖對LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞凋亡具有明顯的抑制作用, 可提高細胞存活率、阻滯凋亡細胞于S期進而促進細胞DNA的合成, 其保護作用主要與黃芪多糖促進了乳腺上皮細胞的增殖有關。2)通過影響乳成分合成改善泌乳功能。LPS對乳成分的合成具有一定的影響。LPS能夠下調乳腺上皮細胞脂肪酸攝取、活化與轉運等相關基因表達, 從而抑制乳脂合成; 通過影響雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖S6蛋白激酶1(S6K1)以及Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)-轉導及轉錄激活因子5(STAT5)等細胞內信號途徑減少乳蛋白的合成; 通過抑制葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter, GLUT)基因表達影響乳糖合成[32]。占今舜[33]研究表明, 在LPS刺激下, 添加苜蓿黃酮會通過提高STAT5 mRNA的表達量, 促使S6K1蛋白磷酸化, 增強含嘧啶基因mRNA的翻譯功能, 進而促進乳蛋白的合成。此外, 添加苜蓿黃酮能通過上調GLUT1、GLUT4和GLUT8 mRNA的表達量, 協助血糖進入乳腺細胞, 促進乳糖合成。3)通過修復血乳屏障維護泌乳功能。血乳屏障完整性是保證乳腺組織正常發揮泌乳功能的前提, 乳腺上皮細胞間的緊密連接是保持血乳屏障完整性的關鍵結構?？缒さ鞍准易錥閉鎖蛋白(occludin)和閉合蛋白(claudin)]、膜周蛋白家族[閉合小環蛋白(ZO)]是乳腺上皮細胞中重要的緊密連接蛋白, 直接影響細胞之間的緊密連接結構。乳腺炎會增加血乳屏障通透性, 并通過影響緊密連接蛋白表達破壞緊密連接, 導致大量離子(Na+、Cl-等)從血液通過血乳屏障滲入乳汁中, 改變pH和電導率, 當損傷進一步加重時, 甚至會出現血乳[34]。Guo等[35]研究指出, LPS組的熒光素(FITC)標記的白蛋白可以從間質進入乳腺腺泡, 表明血乳屏障被破壞, 而乳腺腺泡中的FITC-白蛋白隨著體內甘草查耳酮劑量的增加而逐漸降低; 同時甘草查耳酮可以增加乳腺組織claudin-3、occludin和ZO-1的蛋白質水平, 表明甘草查耳酮通過增加緊密連接蛋白表達量來改善LPS作用下血乳屏障的完整性, 從而降低乳腺炎的損傷程度。與Kan等[36]在類黃酮化合物楊梅素和Wang等[34]在丁酸鈉上的研究結果一致。因此, 修復血乳屏障是一種治療乳房炎的有效策略。

綜上可知, 植物提取物能夠促進乳腺上皮細胞增殖, 增加奶牛產奶量, 改善乳汁成分, 維護血乳屏障完整性, 進而提升乳房炎奶牛的泌乳功能。另外, 應將體外細胞試驗與乳房炎奶牛動物模型相結合, 以便更加準確全面地研究植物提取物對乳房炎奶牛泌乳功能的影響及機制, 才能更好地防治乳房炎, 為奶牛養殖業創造更大的經濟效益。

4 小結
植物提取物具有豐富的生物多樣性和巨大的藥用潛力, 能夠作為抗生素替代物, 從抗菌、炎癥調節、改善泌乳功能等多方面安全有效地防治奶牛乳房炎。目前, 關于植物提取物在奶牛乳房炎上的機理研究多集中于細胞分子階段, 在奶牛體內如何通過瘤胃和乳腺代謝轉化發揮作用還缺乏有力的證據。此外, 植物提取物飼喂、灌服、外敷、注射等不同牛體施用方式效果差異還有待進一步驗證。植物提取物對奶牛乳房炎的影響及作用機制的深入研究對于保障奶牛乳腺健康及植物提取物的開發利用具有重要價值。