摘要：為了探究百里香酚對山羊子宮內膜上皮細胞（ ｇｏａｔ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｇＥＥＣｓ）的毒性作用，采用不同濃度的百里香酚作用于 ｇＥＥＣｓ 后，觀測其對細胞生長曲線，細胞形態學變化，以及細胞膜結構完整性的影響。 結果表明，百里香酚對 ＥＥＣｓ 的毒性作用與其濃度呈劑量依賴效應（ｙ＝ －０．００８ｘ＋１．２２０２，Ｒ ２ ＝ ０．９７６７），即隨著藥物濃度的增加細胞的增殖抑制率增大，藥物對細胞的半數增殖抑制率（ＩＣ ５０ ）為 １００ μｇ／ ｍＬ。 當 ５０、１００ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚作用于 ＥＥＣｓ 時， ｇＥＥＣｓ 的細胞核、細胞漿的形態均未產生明顯變化，但當 １５０ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚作用于 ｇＥＥＣｓ 時，細胞膜破裂，細胞死亡；而且藥物濃度≥１００ μｇ／ ｍＬ 時細胞 ＬＤＨ 的釋放量顯著高于正常細胞組，ｇＥＥＣｓ 細胞膜的完整性受到破壞。 百里香酚作用于山羊子宮內膜上皮細胞后呈現一定的毒性作用，且毒性作用和藥物的濃度有關。 百里香酚作用于 ｇＥＥＣｓ 的安全范圍在 ０～１００ μｇ／ ｍＬ，研究結果為百里香酚治療奶牛等經濟動物的炎癥性疾病的臨床用藥濃度提供理論依據。
關鍵詞：百里香酚；子宮內膜上皮細胞；細胞毒性；膜通透性
作者：閆寶琪，張世棟，董書偉，王東升，那立冬，桑夢琪，楊洪早，嚴作廷

子宮內膜炎（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｔｉｓ） 是奶牛的常見病之一，多發生于產后，是病原菌感染子宮內膜引起的炎癥，常導致奶牛屢配不孕 ［１－２］ 。 該病可造成奶牛生理功能紊亂、產奶量下降，甚至終生不孕而被淘汰，給養殖戶造成嚴重危害，經濟損失巨大。 據中國奶牛協會統計，奶牛的繁殖障礙發生率高于其他牛，而且在不孕的病因中以子宮內膜炎引起的不孕牛所占比例最高 ［３，４］ 。 臨床上，大量抗生素和激素應用于治療子宮內膜炎，導致耐藥菌株的不斷產生，抗生素殘留，治療效率明顯降低。 中草藥具有明顯的抗菌消炎，毒副作用小，增強免疫力，改善血液循環和增加子宮收縮的作用，所以近十幾年來關于應用中草藥治療子宮內膜炎的研究成為熱點 ［５－６］

百里香酚是一種單萜酚類物質，最初從百里草中分離而得名，即 ５－甲基－２－異丙基苯酚（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｉｓｏ－ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏ１）［７］ 。 研究發現百里香酚具有廣譜抗菌活性，對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等均具有抑制作用 ［８］ 。 Ａｒａ?ｎｔｘａ Ａｚｎａｒ 等 ［９］ 研究發現將百里香酚、香芹酚和甲基混合后在 ２５ ℃ 下能夠有效抑制酵母菌繁殖生長，抑制時間長達２１ ｄ。 Ｏｍｒａｎ 等的研究也發現，百里香精油對外陰道念珠菌有較強的抗真菌活性，其效果優于氟康唑，與 １ μｇ／ ｍＬ 的兩性霉素 Ｂ 的抗真菌效果相當 ［１０］ 。 體外實驗表明，百里香酚可以顯著抑制低密度氧化脂蛋白誘導的人ＴＨＰ－１單核細胞促炎性細胞因子ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６ 并促進 ＩＬ－１０ 的基因和蛋白表達水平，對一些炎癥類疾病如皮炎、胸膜炎、腹膜炎和風濕性關節炎等均具有抗炎促愈合功能 ［１１－１２］ 。

綜上所述，百里香酚有較好的抑菌抗炎效果，對于一些炎癥性疾病具有較好的應用前景，但應用百里香酚治療奶牛等經濟動物的子宮內膜炎的研究還未見報道。 近年來，利用子宮內膜細胞的體外培養檢測子宮生理功能的研究不斷呈現新的進展，同時利用 ＬＰＳ 刺激子宮內膜上皮細胞建立的炎癥模型檢測炎癥信號通路以及中草藥抗炎機制的報道也在不斷增加 ［１３－１４］ 。 實驗中，篩選出中草藥作用于細胞無毒性作用的濃度是在分子細胞水平上檢測中草藥抗炎作用的前提條件。 因此，試驗采用山羊子宮內膜上皮細胞（ｇＥＥＣＳ）作為材料，研究百里香酚對其的毒性作用，以期為百里香酚治療奶牛子宮內膜炎的臨床用藥研究提供理論依據。

１　材　料
１．１．１　 細胞　 
山羊子宮內膜上皮細胞系（ＥＥＣｓ），由西北農林科技大學動物醫學院靳亞平教授惠贈。
１．１．２　 主要儀器及設備　 
Ｍｅｍｍｅｒｔ ＣＯ２ 培養箱；ＨｅａＬ ＦｏｒｃｅＢ２ 型生物安全柜；ＳＷ－ＣＪ－１ＣＵ型超凈工作臺；倒置顯微鏡，Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ６０００Ｂ；ＭＤＣ Ｍ２ｅ 型多功 能 酶 標 儀； 細 胞 培 養 瓶、 培 養 板 為 美 國ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ產品。
１．１．３　藥品及試劑　 
百里香酚 （Ｔｈｙｍｏｌ， Ｂ２１１５３，１００ ｍｇ），用含 ０．０５％的 ＤＭＳＯ 將其稀釋到所需要的濃度；ＤＭＥＭ／ Ｆ１２ 培養基為 Ｇｉｂｃｏ 公司產品；胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）為杭州四季青公司產品；０．０１ ｍｏｌ／ Ｌ 磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２～ ７．４）；ＭＴＴ 為 Ｓｉｇｍａ 公司產品以 ０．０１ ｍｏｌ／ Ｌ ＰＢＳ 溶解至 ５ ｍｇ／ ｍＬ；瑞氏、姬姆薩染料為 Ｓｏｌａｒｂｉｏ 公司產品；ＬＤＨ 檢測試劑盒（貨號 Ａ０２０－２）為南京建成生物工程研究所有限公司產品。
１．２　方法
１．２．１　 細胞培養　 
從液氮中取出永生化山羊子宮內膜上皮細胞（ＥＥＣｓ），３７ ℃快速復蘇，低速離心后添加含 １０％ＦＢＳ、１００ Ｕ／ ｍＬ 青霉素和 １００ μｇ／ ｍＬ鏈霉素的 ＤＭＥＭ／ Ｆ１２ 培養基，置于 ３７ ℃、５％ ＣＯ ２飽和濕度的培養箱內培養。
１．２．２　 細胞分組與處理　 
取 １００ μＬ 濃度為 ５×１０ ４ 個／ ｍＬ的細胞懸液接種于 ９６ 孔培養板，２４ ｈ后棄去舊培養基，加入含不同濃度的百里香酚的完全培養液 １００ μＬ，百里香酚的終濃度分別為：０、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０ μｇ／ ｍＬ，每個濃度設置 ８ 個復孔。
１．２．３　ＭＴＴ 檢測百里香酚對細胞的增殖作用　 
繼續培養 ４８ ｈ 后，觀察細胞增殖情況。 棄去舊培養基，加入 ５ ｍｇ／ ｍＬ 的 ＭＴＴ ２０ μＬ，孵育 ４ ｈ。 棄去多余的 ＭＴＴ，每孔加入 ２００ μＬ 二甲基亞砜，低速振蕩１０ ｍｉｎ，使結晶物充分溶解后在酶標儀上以 ５７０ ｎｍ檢測各孔 ＯＤ 值，并以不含細胞的孔調零，記錄各孔 ＯＤ 值， 計 算 細 胞 的 半 數 增 殖 抑 制 率（ＩＣ ５０ ）［１５－１６］ 。 以藥物濃度為橫坐標，細胞相對存活率為縱坐標，繪制曲線。Ａ ０ ：藥物處理前 ＯＤ 值；Ａ １ ：對照組 ＯＤ 值；Ａ ２ ：藥物處理 ４８ ｈ 后 ＯＤ 值；ＩＣ ５０ ＝（Ａ ２－Ａ０ ） ／ （Ａ １－Ａ０ ）×１００％
１．２．４　百里香酚對 ＥＥＣＳ 的形態的影響
取 １ ｍＬ濃度為 ５×１０ ４ 個／ ｍＬ 的細胞懸液接種于 １２ 孔培養板，培養 ２４ ｈ 后棄去舊培養基，加入含百里香酚終濃度為 ０、１００ 、１５０ μｇ／ ｍＬ 的完全培養液１ ｍＬ，每個濃度設置 ４ 個復孔。 繼續培養 ４８ ｈ后收集細胞（１２００ ｒ／ ｍｉｎ，５ ｍｉｎ），加入 ５００ μＬ的無菌 ＰＢＳ 重懸細胞，涂片，晾干，放入預冷的甲醇溶液中固定 １５ ～ ３０ ｍｉｎ。 接著滴加 ２ ～ ３ 滴瑞氏染液，染色 ２～３ ｍｉｎ 后滴加等量的吉姆薩染液，染色 １０ ｍｉｎ。 每張涂片計數 １００ 個細胞，于顯微鏡下觀察細胞形態 ［１７－１９］ 。
１．２．５　ＥＥＣｓ 細胞膜完整性的檢測　 
取 ０．５ ｍＬ 濃度約為 ５×１０ ４ 個／ ｍＬ 的細胞懸液接種于 ２４ 孔培養板，培養 ２４ ｈ 后，棄去舊培養基。 分別加入含百里香酚 終 濃 度 為 ０、 １０、 ２０、 ４０、 ６０、 ８０、 １００、 １２０、１５０ μｇ／ ｍＬ的完全培養液 ０．５ ｍＬ，每組設三個重復孔。 繼續培養 ４８ ｈ 后收集細胞上清液，６６００ ｒ／ ｍｉｎ，離心 １０ ｍｉｎ，嚴格按照 ＬＤＨ 檢測試劑盒說明書操作，檢測各組上清液中 ＬＤＨ 的含量。
１．２．６　 統計學方法　 
應用 ＳＡＳ ９．３０ 軟件分析數據，Ｅｘｃｅｌ 繪圖軟件進行繪圖。 結果以平均值±標準差表示，實驗結果采用單因素方差分析進行統計學分析。

２　結果與分析
２．１　百里香酚對 ＥＥＣｓ 增殖的影響
結果發現，當百里香酚的濃度處在 １０ ～ １５０ μｇ／ ｍＬ 時，對 ＥＥＣｓ有增殖抑制作用。 隨著藥物濃度的升高對細胞的抑制作用越明顯，且細胞的增殖抑殖率與藥物的濃度 呈 一 定 的 線 性 關 系 （ ｙ＝－０．００８ｘ＋１．２２０２，Ｒ ２ ＝０．９７６７，如圖 １）。 由此可計算，當細胞的增殖抑制率為 ０．５ 時（ＩＣ ５０ ），百里香酚的作用濃度為１００ μｇ／ ｍＬ。
２．２　 百里香酚對 ＥＥＣｓ 的細胞形態影響　 
正常的山羊子宮內膜上皮細胞多數為梭形，少數呈三角形，核圓居中，培養２４ ｈ 后，細胞交織成網狀。 細胞貼壁良好，體積較大、折光性好，形態大小均勻一致（如 圖 ３Ａ， 大 圖 為 １００ ×， 小 圖 為 ４００ ×）； 經１００ μｇ／ ｍＬ百里香酚處理 ４８ ｈ 后，ＥＥＣｓ 的密度增大，且在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態良好（如圖 ３Ｂ，大圖為 １００×，小圖為 ４００×）；由圖 Ｃ 可以看出當百里香酚濃度達到 １５０ μｇ／ ｍＬ 時，作用相同的時間細胞出現死亡現象，細胞結構遭到破壞，細胞膜破裂，細胞核暴露，視野內有大量的細胞碎片存在（如圖 ３Ｃ，大圖為 １００×，小圖為 ４００×）。

２．３　百里香酚對 ＥＥＣｓ 的細胞核形態影響
瑞氏－姬姆薩染色使細胞核呈深淺不同的紫紅色，胞漿呈淺藍色。 染色結果顯示正常組和經１００ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚作用 ４８ ｈ 的細胞的胞質和胞核界限清晰，胞核完整，胞漿均勻，細胞邊緣完整，視野內未出現死亡細胞以及形態異常的細胞。 （如圖 ４ａ，４ｂ，大圖為 １００×，小圖為 ４００×）。當百里香酚的濃度達到 １５０ μｇ／ ｍＬ 時，染色結果顯示大部分細胞的細胞膜完整性遭到破壞。與正常細胞組相比，視野內少數細胞其細胞膜著色變淺，且細胞核多位于細胞膜邊緣；大多數細胞的細胞膜完全消失，視野內只有紫紅色的細胞核存在，但大多數細胞核結構完整，只有少量的細胞核發生破碎裂解。

２．４　百里香酚對 ＥＥＣｓ 細胞膜完整性的影響
測定結果顯示：隨著百里香酚濃度的升高，細胞培養液中 ＬＤＨ 的含量有升高的趨勢，但不存在規律性增長。 且與對照組相比，當百里香酚的濃度大于 １００ μｇ／ ｍＬ 時細胞培養液中 ＬＤＨ 的含量顯著升高（Ｐ＜ ０．０１）；與對照組相比 １０、２０、４０、６０、８０、１００ μｇ／ ｍＬ的百里香酚作用細胞后培養液中 ＬＤＨ的含量雖然升高，但不存在顯著性差異（Ｐ＞ ０．０５），如圖 ４ 所示。
３　討　論
研究報道，通過陰道給藥治療婦科炎癥具有可避免口服給藥的首關效應和血藥濃度的谷峰現象，避免藥物對于胃腸道的刺激，避免注射給藥的疼痛與心理恐懼，通過“ Ｆｉｒｓｔ ｕｔｅｒｉｎｅ－ｐａｓｓｅｆｆｅｃｔ ”能夠將藥物靶向傳遞到子宮內膜組織，因此，生物利用度高、藥效顯著 ［２０］ 。 百里香酚具有抗炎、調節免疫力、抗氧化、抗癌等多種生物活性，在臨床治療中具有較好的應用前景，在將來的研究中百里香酚可以被開發成一種新型的子宮灌注劑，采用陰道給藥治療奶牛等經濟動物的子宮內膜炎。 那么，探明百里香酚對子宮內膜上皮細胞的刺激作用以及毒性作用是闡明其臨床用藥安全性的必要前提條件。 所以試驗開展百里香酚對子宮內膜上皮細胞體外的毒活性研究，為百里香酚治療奶牛等經濟動物子宮內膜炎的臨床應用提供理論依據。

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的 ＭＴＴ 還原為難溶性的藍紫色結晶物甲臜，并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。 甲臜被溶解后所測得的光密度值越小，說明細胞存活率越低 ［２１－２２］ 。本研究中 ＭＴＴ 的結果表明，百里香酚對 ＥＥＣｓ 的增殖抑制作用與其濃度成一定的關系，當濃度為１００ μｇ／ ｍＬ時達到 ＥＥＣｓ 的半數增值抑制率，因此可選用 ０～１００ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚作用于 ＥＥＣｓ 行抗炎效果的研究。 而在梁德潔 ［２３］ 用百里香酚對ＬＰＳ 誘發的乳腺炎小鼠的保護作用及作用機制研究中選取百里香酚對小鼠乳腺上皮細胞無毒性影響的最大濃度為 ４０ μｇ／ ｍＬ。 這可能與百里香酚作用的細胞種類不同，細胞接種數量不同，實驗操作不同等因素有關。

乳酸脫氫酶（ＬＤＨ） 是活細胞胞質內廣泛存在的酶之一，正常情況下 ＬＤＨ 不能透過細胞膜，但當細胞膜受損或細胞死亡導致細胞膜通透性改變時，則會釋放到培養液中，釋放的 ＬＤＨ 與細胞膜的損傷程度或細胞死亡數成正比 ［２４］ 。 檢測培養液中 ＬＤＨ 的含量可判斷細胞膜的受損程度。 本研 究 結 果 顯 示， 當 百 里 香 酚 的 濃 度 ≥１００ μｇ／ ｍＬ時細胞釋放的 ＬＤＨ 含量顯著升高，說明該濃度的百里香酚可顯著引起細胞膜通透性增大。 此外，細胞生長狀態和瑞氏－姬姆薩染色結果顯示，１５０ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚對 ＥＥＣｓ 的細胞膜能造成嚴重損傷，細胞膜破裂，細胞死亡。這一實驗結果和之前的研究報道類似，Ｎｏｓｔｒｏ等 ［２５］ 研究也報道百里香酚可以抑制金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜形成。 百里香酚可以通過影響細菌胞內 ｐＨ 穩態和無機離子平衡，從而破壞生物膜完整性對白色念珠菌產生抑制作用。 一步的研究表明，百里香酚可以增加小鼠平滑肌細胞胞膜去極化，導致肌質網 Ｃａ２＋離子釋放，影響細胞膜的通透性 ［２６－２８］ 。 由此可見，百里香酚能夠破壞細胞膜的完整性，而且這可能與藥物被細胞膜的轉運吸收有關。

Ｚｕ 等 ［２６］ 人研究證實，由于百里香精油對人類癌癥細胞具有較強的細胞毒性，因此百里香精油也具有一定的抗癌作用。 其對ＰＣ－３、Ａ５４９ 和· ９ ３ 中國獸藥雜志 ２０１７，５１（４）：３５～４１／ 閆寶琪，等ＭＣＦ－７腫瘤細胞株 ５０％抑制濃度（ＩＣ５０）分別為０．０１０％ （ Ｖ／ Ｖ ）、 ０．０１１％ （ Ｖ／ Ｖ ） 和 ０．０３０％（Ｖ／ Ｖ）。 此外香芹酚和百里香酚作為目前應用最為廣泛的重要香料之一，被廣泛應用于飼料添加以及一些口腔衛生品和洗滌物品 ［２７］ 。

４　結　論
百里香酚對山羊子宮內膜上皮細胞的安全劑量為≤１００μｇ／ ｍＬ，該劑量范圍內藥物對細胞活力和形態結構無顯著影響；大于該劑量的百里香酚可顯著增大子宮內膜上皮細胞的膜通透性，產生細胞毒性作用。 綜上所述，百里香酚對細胞的毒性作用的研究為其治療奶牛等經濟動物的炎癥性疾病，癌細胞的抑制作用，以及作為食品添加劑的安全使用劑量提供一定的理論依據和參考價值。
（參考文獻略）