作者：陶勇，楊曉志，王見悠，徐斌，任善茂，孫清平 

摘 要：本試驗旨在研究單寧和氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬糞便菌群及血清免疫、抗氧化和肝臟功能相關血液生化指標的影響。選用體重相近， ２５日齡杜×長×大斷奶仔豬２７０頭，隨機分成９組，每組３個重復，每個重復１０頭豬。對照組飼喂基礎日糧加高鋅（ ３　０００ｍｇ ／ｋｇ氧化鋅）的日糧，試驗１～８組（ Ｔ１～Ｔ８ ）分別飼喂基礎日糧添加以下氧化鋅與單寧組合的日糧：（ ２　０００＋０ ）、（２　０００＋１　０００ ）、（ １　０００＋０ ）、（ １　０００＋１　０００ ）、（ １　０００＋１　５００ ）、（ １　０００＋２　０００ ）、（ ０＋１　５００ ）、（ ０＋２　０００ ）ｍｇ／ｋｇ 。試驗期３０ｄ。分別于試驗的第１４與２８天采集仔豬新鮮糞樣，測定糞便中各細菌的數量。試驗結束采集血樣，測定血清免疫、抗氧化及肝臟功能相關指標。結果顯示，試驗第１４天，各組斷奶仔豬糞便大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌數量均無顯著差異（ Ｐ ＞０．０５ ）。試驗第２８天， Ｔ１ 、 Ｔ６組斷奶仔豬糞便乳酸菌數量極顯著高于對照組（ Ｐ ＜０．０１ ），而雙歧桿菌數量則顯著高于對照組（Ｐ ＜０．０５ ），但各組大腸桿菌數量均無顯著差異（ Ｐ ＞０．０５ ）。各組斷奶仔豬血清中 ＩｇＧ 和 ＩｇＡ 含量、ＭＤＡ 含量及 ＧＳＨ － Ｐｘ 活力均無顯著差異（ Ｐ ＞０．０５ ）。但 Ｔ５ 、 Ｔ６ 、 Ｔ７ 、 Ｔ８ 組斷奶仔豬血清 ＧＳＨ 含量極顯著高于對照組（ Ｐ ＜０．０１ ）。除了 Ｔ２ 和 Ｔ５ 組，其余各組豬血清谷草轉氨酶活性均顯著或極顯著低于高鋅對照組（ Ｐ ＜０．０５ ； Ｐ ＜０．０１ ）。本試驗結果表明，與單一使用高劑量氧化鋅相比，單寧與氧化鋅適量水平組合有利于乳酸菌及雙歧桿菌的增殖、提高斷奶仔豬抗氧化能力并對肝臟產生保護作用。

仔豬早期斷奶應激綜合征一直是養豬生產中的重要問題，其常見臨床表現為腹瀉、采食量下降、生長停滯、抗病力下降等 。為了減緩斷奶應激綜合征，在斷奶仔豬飼料中常采用高劑量的氧化鋅同時添加抗生素。高劑量氧化鋅的使用增加了糞便中鋅的含量，糞便直接還田后其所含的鋅卻不能被降解 ，因而產生了嚴重的環境污染。而豬飼料中長期大劑量添加抗生素也會產生耐藥性、畜產品藥物殘留等一系列問題。面對中國發展綠色環保、低抗甚至無抗養殖的新形勢，斷奶仔豬生產中亟需尋找新型的綠色飼料添加劑以降低仔豬腹瀉、提高仔豬抗病力。

單寧是一種天然的植物多酚，包括聚合單寧和水解單寧，其廣泛分布于植物中。大麥、高粱、油菜籽及蠶豆中富含單寧，并主要以聚合形式存在。傳統動物營養中單寧作為抗營養物質被人們所熟知，已知聚合單寧及水解單寧均具有抗營養作用。飼料中高含量的單寧會影響飼料的適口性，降低飼料中能量、粗蛋白質、礦物質和氨基酸的消化率 ，從而降低動物生長性能 。現代動物營養中體外研究表明，單寧對多種有害微生物均具有抑制或殺滅作用，可作為潛在的抗菌促生長劑。動物試驗也表明，豬飼料中低劑量單寧可有效控制腹瀉。迄今為止，僅見斷奶仔豬飼料中單一使用單寧或高劑量氧化鋅的研究，而單寧與氧化鋅組合使用對斷奶仔豬作用的研究鮮有報道。本試驗通過在斷奶仔豬日糧中將單寧與氧化鋅組合使用，研究其對糞便菌群、血清免疫指標、抗氧化指標及肝臟功能相關生化指標的影響，以確定國內養殖條件下斷奶仔豬日糧中單寧及氧化鋅組合使用替代高劑量氧化鋅的可行性。

１材料與方法
１．１　材料
邁多芬－單寧由邁特多（江蘇）生物技術有限公司提供，含量 ≥８５％ ，全植物源性產品，部分水解。大腸桿菌測定用結晶紫中性紅膽鹽瓊脂、乳酸菌測定用 ＭＲＳ培養基及雙歧桿菌測定用雙歧桿菌瓊脂培養基均購自北京陸橋技術股份有限公司；免疫球蛋白 Ｇ （ ＩｇＧ ）測定試劑盒、免疫球蛋白 Ａ （ＩｇＡ ）測定試劑盒、丙二醛（ ＭＤＡ ）測定試劑盒（ＴＢＡ 法）、還原型谷胱甘肽（ ＧＳＨ ）測定試劑盒（微板法）及谷胱甘肽過氧化物酶（ ＧＳＨ － Ｐｘ ）測定試劑盒（比色法）均購自南京建成生物工程研究所。酶標儀（型號為ＳＨ －１０００ ）購自日本日冠電氣公司。

１．２ 試驗設計

試驗豬由江蘇省揚州市三生畜牧有限公司提供。選用健康的體重相近的２５日齡杜×長×大斷奶仔豬２７０頭，隨機分成９組，每組３個重復，每個重復１０頭豬。各組豬初始體重差異不顯著（ Ｐ ＞０．０５ ）。基礎日糧中含鋅１４０ｍｇ ／ｋｇ，對照組（ Ｃ ）日糧為基礎日糧加高鋅（３０００ｍｇ／ｋｇ氧化鋅），試驗組１～８組（ Ｔ１～Ｔ８ ）日糧為基礎日糧中分別添加以下氧化鋅與單寧組合：（２　０００＋０ ）、（ ２　０００＋１　０００ ）、（１　０００＋０ ）、（ １　０００＋１　０００ ）、（ １　０００＋１　５００ ）、（１　０００＋２　０００ ）、（ ０＋１　５００ ）、（ ０＋２　０００ ）ｍｇ／ｋｇ。基礎日糧組成及營養水平見表１ 。試驗期為３０ｄ 

１．３ 動物飼養管理
飼養試驗于２０１８年４月 ～２０１８年５月在揚州邁特多（江蘇）生物技術有限公司試驗豬場進行。試驗豬自由采食及飲水。按飼養場正常飼養管理程序和防疫程序進行管理，所有試驗豬飼養管理條件均相同。

１．４ 測定指標及測定方法
１．４．１ 糞便微生物測定 　　 
將采樣用５ｍＬ試管及寬嘴鑷于１２１ ℃高壓滅菌２０ｍｉｎ后烘干備用。分別于試驗的第１４ 、 ２８天從每個重復中隨機選擇兩頭豬，即每個處理６頭，每頭豬采集約３ｇ 新鮮糞便置于試管內，并迅速放入冰盒中保存。采樣結束后，將存有糞樣的試管放入４℃冰箱保存，并于２４ｈ內完成測定。按培養基說明書制備大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌培養基。用常規方法檢測糞便中的大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌的數量，每個樣品做３個重復，結果以ｌｇＣＦＵ ／ ｇ 表示。
１．４．２ 血清免疫指標測定 　　 
試驗結束，每個重復隨機選擇兩頭豬，即每個處理 ６ 頭豬，前腔靜脈采血， ３　７００ｒ ／ ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ ，取上清于－２０℃保存，待測。通 過 ＥＬＩＳＡ 試劑盒測 定 血 清ＩｇＧ 和ＩｇＡ 的含量，酶標儀測定 ４５０ｎｍ 處的吸光度，并用 ＥＬＩＳＡｃａｌｃ軟件計算結果。
１．４．３ 血清抗氧化指標測定 　　 
使用試劑盒，通過硫代巴比妥酸法檢測血清中 ＭＤＡ 含量，微量酶標法檢測血清 ＧＳＨ 含量，并測定血清中 ＧＳＨ －Ｐｘ活力。
１．４．４ 肝臟功能相關的血清生化指標測定 　　 
采用血清生化測定儀測定血清中的總蛋白（ ＴＰ ）、白蛋白（ ＡＬＢ ）、球蛋白（ＧＬＯ ）含量及谷丙轉氨酶（ ＡＬＴ ）和谷草轉氨酶（ ＡＳＴ ）活性。

１．５ 數據分析
采用Ｅｘｃｅｌ對數據進行初步整理。使用 ＳＰＳＳ２０．０ 軟件中的單因素方差分析（ Ｏｎｅ －ＷａｙＡＮＯ －ＶＡ ）進行分析， Ｄｕｎｃａｎ氏法進行多重比較。結果均以平均值±標準誤表示，以 Ｐ ＜０．０５為差異顯著性判斷標準，以 Ｐ ＜０．０１為差異極顯著性判斷標準。

２　 結果
２．１　 單寧和氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬糞便菌群的影響

由表２可知，試驗第１４天各組斷奶仔豬糞便中大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌數量均無顯著差異（Ｐ ＞０．０５ ）。試驗第２８天，各組斷奶仔豬糞便中大腸桿菌數量仍無顯著差異（Ｐ ＞０．０５ ）；但 Ｔ３組斷奶仔豬糞便乳酸菌數量顯著高于對照組（ Ｐ ＜０．０５ ），Ｔ１ 、 Ｔ２ 、 Ｔ５ 、 Ｔ６組斷奶仔豬糞便乳酸菌數量極顯著高于對照組（ Ｐ ＜０．０１ ），其他各試驗組與對照組相比均無顯著差異（ Ｐ ＞０．０５ ）；Ｔ１ 、 Ｔ６組斷奶仔豬糞便雙歧桿菌數量顯著高于對照組（ Ｐ ＜０．０５ ），Ｔ４組極顯著高于對照組（ Ｐ ＜０．０１ ），其他各試驗組與對照組相比均無顯著差異（Ｐ ＞０．０５ ）。

２．２ 單寧和氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬血清

免疫指標的影響由表３可知，各組斷奶仔豬血清中ＩｇＧ 和ＩｇＡ含量均無顯著差異（Ｐ ＞０．０５ ）。

２．３ 單寧和氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響

由表４可知，各組斷奶仔豬血清中 ＭＤＡ 含量及 ＧＳＨ －Ｐｘ活力均無顯著差異（ Ｐ ＞０．０５）。但 Ｔ５、Ｔ６ 、 Ｔ７ 、 Ｔ８組斷奶仔豬血清 ＧＳＨ 含量極顯著高于對照組（ Ｐ ＜０．０１ ），其他各試驗組與對照組相比均無顯著差異（ Ｐ ＞０．０５ ）。

２．４ 單寧和氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬肝臟功能相關的血清生化指標的影響
由表５可知，各組斷奶仔豬血清中總蛋白、白蛋白和球蛋白含量無顯著差異（ Ｐ ＞０．０５ ），血清白球比和谷丙轉氨酶活性亦無顯著差異（Ｐ ＞０．０５ ）。 Ｔ３和 Ｔ４組谷草轉氨酶活性均顯著低于高鋅對照組（Ｐ ＜０．０５ ）， Ｔ１ 、 Ｔ６ 、 Ｔ７和 Ｔ８組谷草轉氨酶活性則極顯著低于高鋅對照組（Ｐ ＜０．０１ ）。

３　 討 論
３．１　 單寧與氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬糞便菌群的影響
單寧存在于多種植物的皮與籽實中，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌均具有抑 制和殺滅作用 ，在仔豬飼料中添加單寧可有效控制腹瀉。單寧控制仔豬腹瀉與其抑菌及殺菌作用有關。單寧抑菌作用的機制可能是由于其可抑制胞外細菌酶的分泌，剝奪微生物生長所需的底物或通過氧化磷酸化作用直接作用于微生物代謝。單寧與鐵結合的能力 被 認為 是單 寧 抑 菌 特 性 的 機制。在１５ｋｇ仔豬基礎日糧中添加１　０００ｍｇ／ｋｇ堅木單寧２８ｄ后降低了豬糞便中大腸桿菌數量。在２１ｄ斷奶仔豬飼料中添加不同劑量的（１２５～１　０００ｍｇｋｇ ）單寧發現，試驗第 ２周隨著日糧中單寧添加量的升高，糞便中大腸桿菌數量下降，而在試驗的第４周，未見單寧的添加對糞便微生物的顯著影響。本研究中試驗第２周，不同氧化鋅與單寧組合日糧均未對糞便各微生物數量產生影響，但在試驗第 ４ 周氧化鋅與單寧組合為（１　０００＋２　０００ ）ｍｇ／ｋｇ組及（２　０００＋０ ）ｍｇ／ｋｇ組糞便中乳酸菌和雙歧桿菌的數量均顯著高于高鋅對照組，但各組大腸桿菌數量差異不顯著。這與高鋅降低斷奶仔豬糞樣中乳酸桿菌種群數量的結論一致  。以上結果表明，氧化鋅與單寧組合后對大腸桿菌抑菌作用與使用高鋅（３　０００ｍｇ／ｋｇ氧化鋅）相當，但對乳酸菌及雙歧桿菌的作用相當或優于高
鋅，其作用取決于單寧與氧化鋅的組合劑量。

３．２　 單寧與氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬血清免疫指標的影響
單寧 對 豬 免 疫 機 能 影 響 的 研 究 較 少。在生長豬飼料中添加０．５％的單寧發現，飼喂４２ｄ 后與基礎日糧組相比，提高了血清 ＩｇＧ 和 ＩｇＭ含量，但未影響ＩｇＡ 含量。而高鋅對斷奶仔豬免疫機能影響的研究相對較多。在斷奶仔豬日糧中添加３　０００ｍｇ／ｋｇ氧化鋅發現，與對照組相比添加高鋅２１ｄ后可提高血清中ＩｇＭ 含量。在斷奶仔豬日糧中添加３　００ｍｇ／ｋｇ氧化鋅，試驗２８ｄ后與對照組相比提高了血清ＩｇＡ 和ＩｇＧ含量，但未影響ＩｇＭ 含量。免疫球蛋白的差異可能與兩試驗測定時間不一致有關，但均表明高鋅提高了斷奶仔豬體液免疫。本試驗中各試驗組豬血清中ＩｇＧ和ＩｇＡ 含量與高鋅對照組相比均無顯著差異，表明單寧與氧化鋅組合使用后對斷奶仔豬體液免疫作用與使用高鋅相當。

３．３　 單寧與氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響
氧化是引起動物生產性能異常和疾病的重要內源性 因 素。而 植 物 多 酚 類 物 質 則 主 要 通 過 激 活Ｎｒｆ２ ／ ＡＲＥ信號通路，調節機體內抗氧化酶基因的表達，提高抗氧化酶的活性；或增加機體的抗氧化劑如維生素 Ｅ 、維生素 Ｃ 的含量，從而增強動物機體的抗氧化能力。但不同結構、不同性質的多酚對信號通路的調控作用不同，對抗氧化酶活性的影響也有很大差別  。單寧是天然的植物多酚，含有多羥基結構，多 個 研 究 表 明 單 寧 具 有 較 強 的 抗 氧 化 能力  ，而且單寧抗氧化能力的強弱與其來源有關 。斷奶仔豬日糧中添加高鋅也可提高抗氧化酶如ＣｕＺｎ － ＳＯＤ及 ＧＳＨ － Ｐｘ的活性，從而提高機體抗氧化能力 。本研究中降低日糧中氧化鋅的添加量并添加單寧，未影響 ＧＳＨ － Ｐｘ 活性和 ＭＤＡ含量，但有 ４ 組單寧添加組豬血清 ＧＳＨ 含量比高鋅對照組高。 ＧＳＨ 是機體抗氧化系統的重要組成部分，是 ＧＳＨ － Ｐｘ 、谷胱甘肽轉移酶（ ＧＳＴ ）兩種酶的反應底物，谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ － ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓ －ｔｅｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ， γ － ＧＣＳ ）是還原型 ＧＳＨ 合成的限速酶  。本試驗中添加單寧后血清中 ＧＳＨ 含量上升，可能是由于單寧通過 Ｎｒｆ２通路，提高 γ － ＧＣＳ的含量和活性，促進 ＧＳＨ 的合成，從而增強機體的抗氧化能力。單寧與氧化鋅組合使用后機體的抗氧化能力與使用高鋅相當或優于高鋅，具體效果與單寧與氧化鋅的組合用量有關。

３．４　 單寧與氧化鋅不同水平組合對斷奶仔豬肝臟功能相關的血清生化指標的影響
血清中白蛋白和球蛋白含量、白球比、谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶活性是綜合評價肝臟功能的重要指標。本試驗中與高鋅對照組相比，降低斷奶仔豬日糧中的鋅水平并添加單寧降低了血清谷草轉氨酶活性，但未對其他指標產生影響，這表明給斷奶仔豬長期飼喂高鋅日糧可損傷豬肝臟的正常功能，而降低鋅含量并添加單寧則能保護肝臟。研究也證實了在斷奶仔豬日糧中長期添加高鋅對其肝臟功能的損傷作用，當斷奶仔豬采食高鋅４２ｄ時血清中谷丙轉氨酶活性上升，持續采食到７０ｄ血清谷丙 轉 氨 酶 和 谷 草 轉 氨 酶 活 性 均 上 升。 使用高鋅日糧飼喂斷奶仔豬２８ｄ后發現，斷奶仔豬肝細胞出現細胞質空泡，并同時伴有脂肪變性。肝臟具有處理并貯存日糧中高劑量鋅的能力，當斷奶仔豬日糧中添加高鋅后其肝臟中鋅含量將上升到對照組的４～５倍，甚至更高  。隨著高鋅添加時間的延長，肝臟中鋅的蓄積量更高，長期添加高鋅時肝臟鋅含量可高達９５０ｍｇ／ｋｇ。當肝臟中鋅的蓄積量達到一定水平時會對肝臟產生毒性；反之當降低日糧中鋅含量并添加單寧時則肝臟鋅沉積減少，即使長期添加其在肝臟中的蓄積量也未達到中毒劑量。

４　 結論

本試驗結果表明，與單一使用高劑量氧化鋅相比，單寧與氧化鋅適量水平組合有利于斷奶仔豬乳酸菌及雙歧桿菌的增殖、提高機體抗氧化能力并對肝臟產生保護作用。

實驗用的木質素多酚（單寧）-邁多芬是梵藍國際從歐洲引進的新型綠色天然飼料添加劑，由全球植物植物化學領域領導者意大利邁特多Methodo公司出品。主成分是愈創木基G，對羥基苯基H，紫丁香基S三種單體結構單元混合物（含量≥85%），和普通水解單寧酸相比，不苦不澀，適口性好，不影響禽畜的采食量。木質素多酚（單寧）-邁多芬在歐洲作為飼料原料注冊并廣泛應用，不僅有收斂抗腹瀉的功效，而且可以抗菌、消炎、消除氧化應激和腸毒素，且無殘留，沒有耐藥性，是替代抗生素的好選擇。